Détection phénotypiques des Bétalactamases selon EUCAST

 

1. Pré-requis

Un étudiant ou un professeur devrait  maîtriser la lecture et l'interprétation des résultats de l'antibiogramme qualitatif (détermination des phénotypes de résistance des bactérie) et des résultats de l'antibiogramme semi-quantitatif (détermination de CMI et de CMB.) 

-Dans ce contexte , un étudiant devrait reconnaître les familles des antibiotiques et donc  il va pouvoir reconnaître les sigles des antibiotiques. 

b. Reconnaître les inhibiteurs de bétalactamase:

                           - L’acide clavulanique

                           -  Sulbactame

                           - Tazobactame

c. Se rappeller des antibiotiques de la famille de pénicilline et leurs inhibiteurs :

         - soit à l’amoxicilline (AMX) et à l’amoxicilline + l’acide clavulanique (AMC)

         - soit à l’ampicilline (AM) et à l’ampicilline + le sulbactame (SAM)

         -  soit à la ticarcilline (TIC) et à la ticarcilline + l’acide clavulanique(TCC)

       - soit à la pipéracilline (PIP75) et à la pipéracilline + le tazobactame (TZP85)

- se souvenir des antibiotiques de la famille céphalosporine et les inhibiteurs suivant :

               - Cefotaxim (CTX) et cefotaxime + acide clavulanique (CCTX)

               - Ceftazidime (CAZ) et ceftazidime + acide clavulanique (CCAZ)

               - Cefipime (FEP) et FEP + acide clavulanique ( CFEP)

 

- apprendre les atibiotiques de la famille cephamycine:

                -  Céfoxitine

                -   Céfotétan

                - Cefmétazole

1. Mise en évidence d’une pénicillinase ou beta-lactamase de classe A

Dans le but de reconnaitre ce profil de résistance de sécretion de pénicillinase, il devrait vérifier les caractéristiques de pénicillinase sur un antibiogramme :

Caractéristique (1) : Les pénicillinases hydrolysent les antibiotiques de la famille de pénicillines et éventuellement les Cephalosporine de première génération (C1G). Cela signifie que les bactéries deviennent résistantes aux pénicillines et les C1G mais elles demeurent sensibles aux cephalosporines de 2ème, 3ème et 4 ème génération et aux carbapénèmes.

Caractéristique (2) : Les pénicillinases sont inhibées par l’acide clavulanique . Les bactéries deviennent  donc sensibles aux AMC et TCC ;

Caracteristique 3: Les pénicillinases sont exprimées à bas niveau mais elles peuvent par modification de leur gène de régulation être exprimées à haut niveau. On parle alors de pénicillinase à haut niveau ont une action plus large.

- Les pénicillinases à bas niveau : L'activité d'inhibition de AMC et TCC > AMX et TIC ; l'activité d'inhibition reste inchangée pour les uréidopénicillines (PIP), les céphalosporines et les carbapénèmes. 

- Les pénicillinases à haut niveau : L'activité inhibitrice  de AMC et TCC > AMX et TIC ; l' activité inhibitrice est réduite pour les uréidopénicillines (PIP) et les C1G (CF)

 

 

 

 

Pour détecter ce profil de résistance, l'élève devrait comparer sur l’antibiogramme, les diamètres d’inhibition obtenus avec un disque d’une pénicilline seule au diamètre obtenu avec un disque de l’association de cette pénicilline avec un Inhibiteur de bétaLactamase

Interprétation des Résultats :

- Si les diamètres des zones d'inhibition obtenus autour de disque pénicilline associé à l'Inhibiteur de bétalactamase sont supérieurs au diamètre d’inhibition de la pénicilline seule, il y a donc production de pénicillinase par la souche étudiée :

- soit à l’amoxicilline et à l’amoxicilline + l’acide clavulanique ( l'Augmentin)

- soit à l’ampicilline et à l’ampicilline + le sulbactam.

- soit à la ticarcilline et à la ticarcilline + l’acide clavulanique.

- soit à la pipéracilline et à la pipéracilline + le tazobactam

 

PS : Un disque de pénicilline est un disque imprégné d'antibiotique appartenant à la classe de pénicilline !!! (voir le tableau de familles d'antibiotique).

B. Mise en évidence d’une béta-lactamase à spectre élargi (BLSE)

- Caracteristique (1) : Les BLSE sont des béta-lactamases qui inactivent une large partie des béta-lactamines (pénicillines et céphalosporines jusqu’à la 4 ième génération : Les bactéries deviennent ainsi résistantes à l’ensemble des pénicillines et céphalosporines, en particulier aux C3G (CTX, CAZ) et C4G (cefepime ) et aux monobactames (ATM) ; 

- Caractéristique (2 ) : Elles ont la particularité d’être inhibées par l'acide clavulanique : Une image de synergie (inhibition de l’activité enzymatique par l’acide clavulanique) est souvent détectée entre les C3G et AMC ou TCC ;

- Caractéristique 3 : les béta-lactamase à spectre élargi (BLSE) n’hydrolysent pas les céphamycines ( Céfoxitine /Céfotétan/ Cefmétazol) et les carbapénèmes.

 

 

Méthode de diffusion pour la détection des BLSE.

Pour la détection de Blse, on utilise souvent ces disques:

- Un disque contenant un IBL : AMC (Amoxicilline + acide clavulanique) ou TCC (Ticarcilline + acide clavulanique).

- Un disque contenant une cephalosporine C3G : CTX (céfotaxime) ou CAZ (ceftazidime).

Remarque importante: 

- Pour les entérobactéries on utilise AMC et CTX

-  Pour les bacilles Gram négatif oxydase positive on utilise TCC et CAZ.

 

Interprétation des résultats

- S’il y a synergie entre l’IBL et la C3G (une augmentation du diamètre de la zone d’inhibition entre les deux disques. On obtient une image caractéristique de synergie d'action en "bouchon de champagne. La bactérie secrète donc une BLSE et elle est résistante à un grand nombre de B-lactamines. 

- S’il n'y a pas de synergie entre l’IBL et la C3G la souche testée ne produit pas de BLSE.

Kit BLSE:

On compare le diamètre d’inhibition obtenu pour: 

- une C3G seule (ex céfotaxime CTX) avec le diamètre de cette même C3G combinée à l’acide clavulanique (ex : céfotaxime + acide clavulanique CCT),

- ou bien une C3G seule (ex CAZ (ceftazidime). avec le diamètre de cette même C3G combinée à l’acide clavulanique (ex : ceftazidime). + acide clavulanique CCAZ)

- ou bien une C3G seule (ex Cpd (cefpodoxime). avec le diamètre de cette même C3G combinée à l’acide clavulanique (ex : cefpodoxime + acide clavulanique )

 

-  si le diamètre d’inhibition en présence d’acide clavulanique est augmenté d’au moins 5 mm il y a donc une  diminution d'au moins 3 dilutions de la CMI de ces céphalosporines mesurée en présence d’acide clavulanique.

 

NB : les cartouches de disques de C3G qui sont le plus souvent utilisés  au laboratoire de bactériologie sont :

- Les cartouches disques ceftazidime (le meilleur indicateur pour les BLSE dérivées du TEM et du SHV) 

- les cartouches de disques de céfotaxime (le meilleur indicateur pour la détection de BLSE de type CTX-M).

- les cartouches de disques cefpodoxime, comme un bon indicateur pour la recherche de tout type de BLSE

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ETEST® ESBL (ESBL CT/CTL 16/1, ESBL TZ/TZL 32/4 andESBL PM/PML)

E-test est formé de bandelettes, renfermant sur un bout un gradient d’un cépalosporine C3G et sur l’autre bout C3G  et un inhibiteur . Le test est considéré comme positif si il y a une réduction d’au moins de 3 fois de la CMI en présence d’un inhibiteur. Lecture de la CMI de C3G avec et sans inhibiteur de bêta-lactamase. La différence est Significative que si seulement si la CMI de C3G est >ou = 3 à log (C3G + I ): il y a donc production de Bétalactamase.

Ce kit contient:

- Bandelette de C3G :Ceftezidime (TZ) et C3G + inhibiteur : Ceftazidime +Ac. clavulanique (TZL);

- Bandelette de C3G :cefotaxime (CT) et C3G + inhibiteur : Cefotaxime +Ac. clavulanique (CTL);

- Bandelette de C4G :Cefepime (PM) et C3G + inhibiteur : Cefepime +Ac. clavulanique (MPL);

Exemple :

Test positif de BLSE. Les CMI sont: CT> 16 mg/L, LTC 0,064 mg/L, TZ> 32 μg/mL et TZL 0,25 μg/mL. La production de BLSE est suggérée par la réduction d'au moins 3 dilution de la CMI en présence de l’acide clavulanique. De plus, une «zone fantôme» est observée au-dessous du gradient CT.

Abréviations: CT, céfotaxime; CTL, céfotaxime / clavulanate; TZ, ceftazidime; TZL, ceftazidime / clavulanate.

CHROMID® BLSE pour la détection présomptive des entérobactéries productrices de Beta-Lactamase à Spectre Étendu (BLSE):

 Ce type de milieu correspond à des milieux sélectifs classiques pour la détection des entérobactéries productrices de ß-lactamase à spectre élargi (BLSE). En effet, la détection des BLSE se fait grâce à une base nutritive additionnée à un mélange d’antibiotiques, dont le Cefpodoxime. Cet antibiotique est reconnu comme le marqueur de choix de ce mécanisme de résistance.

Principe d’utilisation et de lecture : Toute colonie ayant poussée sur ce type de milieux est suspecte de produire une BLSE (après 18 à 24 heures d’incubation)

 

- Escherichia coli : Coloration rose à bordeaux des souches productrices de ß-glucuronidase 

- Proteae (Proteus, Providencia, Morganella) : Coloration brune à marron des souches exprimant une désaminase. 

- Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter (KESC) :Coloration vert / bleu à vert-brun des souches productrices de ß-glucosidase 

- Inhibition sélective des bactéries Gram positif et des levures 

- Le caractère BLSE doit être vérifié par la technique de synergie dite "en bouchon de champagne

3. Mise en évidence d’une Céphalosporinase

Caractéristiques des céphalosporinases:

Caractéristiques  1: les céphalosporinases hydrolysent les pénicillines, les céphalosporines de 3ième generation sauf les carbapénèmes et les cephalosporine de 4ième G (Cefepime)

Caractéristiques 2: les céphalosporinases hydrolysent cephamycines ( cefoxitine and cefotetane) et  les monobactames ( aztreoname)

Caractéristiques 3: les céphalosporinases ne sont pas  inhibées par l’acide clavulanique et le sulbactame mais elles sont inhibés pae la cloxacilline.

Mast D69C AmpC Detection Disc Set: Kit de Détection phénotypiques des céphalosporinases inductible

NB: céphalosporinase inductible AMPc inductible= Bétalactamase de classe C inductible

La production de céphalosporinase chromosomique est souvent inductible. Le gène AMPc qui règle leur production est soumis au contrôle d'un répresseur dont l'action peut être levée par des "inducteurs" : le gène est alors activement transcrit et la production de la céphalosporinase augmente.

* Les inducteurs peuvent être des imipénemes, des cefoxitine et les des ampicillines.

Méthode: On place, sur le milieu Mueller Hinton : un disque de C3G à côté d'un disque imprégné avec l'un des des inducteurs de céphalosporinase.('imipenème / cefoxitime/ ampicilline)

Interprétation des résultats : Si il y a une image d'antagonisme avec diminution de la zone d'inhibition autour du disque de C3G en regard du disque d'imipenème ou du la cefoxitine /ampicilline, il ya donc la production e céphalosporinase inductible.

4- Mise en évidence de bétalactamases et de céphalosporinases hyperproduites

4.1. Gélose MH-CLOXA

Les entérobactéries du groupe 3 (enterobacter, providencia,Morganella, Hafnia, Serratia, Proteus vulgaris, Citrobacter freundi et E coli) combinent parfois le phenotype BLSE et céphalosporinase hyperproduite .Le phénotype d’hyperproduction de céphalsporinase masque le phénotype BLSE, la souche est résistance de haut niveau aux céphalosporines. En cas d’hyperproduction de céphalosporinase, les diamètres autour des disques de C3G très diminués peuvent masquer les images de synergies évocatrices de BLSE entre des disques de C3G seul et de C3G et d’acide clavulanique.

 

Méthode:

Faire un test de synergie sur milieu Muller et Hinton additionné de cloxacilline inhibiteur de céphalsporinase (entre des disques de ticarcilline+ acide clavulanique et le disque de C3G ( exemple: ceftazidime) (2 cm de centre à centre).

4.2. Kit Mast : la détection de la résistance AmpC et BLSE

Ce kit contient une cartouche de disque de Cefpodoxime et 3 cartouches différentes de disques, chacune contenant l’antibiotique Cefpodoxime additionnée d’un inhibiteur spécifique pour les bétalactamase spectre étendu (acide clavulanique)/ou d’un inhibiteur de l’AMPc (céphalsporinase) qui est cloxacilline.

a. Disque de Cefpodoxime (CPDX)

b. Disque de Cefpodoxime + acide clavulanique (inhibiteur de bétalactamase spectre étendu)

c. disque de Cefpodoxime + cloxacilline (inhibiteur de la céphalosporinase)

d. Disque de Cefpodoxime + acide clavulanique + cloxacilline

Le test AmpC & BLSE Detection kit (Réf.D68C) utilise la technique des disques combinés pour détecter et différencier les souches productrices d’AmpC et de BLSE. L’interprétation est obtenue par comparaison des différentes zones d’inhibition produites.