Compétence I: Réalisation d'un frottis sanguin

 

 

Intérêts de frottis sanguin:

- Confirmation de comptage plaquettaire;

- Différentiel leucocytaire;

- Examen morphologique des globules rouges et blancs.

I. Collection des échantillons

 

Au laboratoire d'hématologie, on réalise souvent des examens de cytologie (numérations et formules sanguines). On recueille des échantillons sur EDTA (tube avec bouchon violet). Ces tubes contiennent de l'acide éthylène diamine tétraacétique disodique ou tripotassique (EDTA), ayant une activité anticoagulante en chélatant le calcium.

Pour avoir un frottis sanguin de bonne qualité, on devrait  recueillir le sang dans des tubes de collecte de sang avec anticoagulant EDTA,  et l'étaler dans les 2 à 3 heures suivant le prélèvement de l'échantillon.

 

Les fottis sanguins qui sont réalisés à partir d'un échantillon conservé  pendant plus de 5 heures à température ambiante ont souvent des effets inacceptables:  on trouve souvent des artefacts de cellules sanguines: exemples les anomalies morphologiques de globules rouges échinocytaires, sphérocytes, leucocytes nécrobiotiques et neutrophiles vacuolés). La vacuolisation des monocytes se produit normalement presque immédiatement avec l'EDTA mais ne pose aucun problème d'évaluation.

 

De plus, l'EDTA inhibe l'agrégation des plaquettes sur la lame de verre, ce qui rend l'estimation visuelle des plaquettes plus précise lors d'un examen de frottis sanguin. Il existe cependant des puristes qui croient que le sang sans anticoagulant est toujours le spécimen de choix pour l'évaluation de la morphologie des cellules sanguines.

Dans certaines conditions, l'utilisation d'un anticoagulant différent de l'EDTA pourrait être utile.En effet, le sang de certains patients subit un phénomène in vitro appelé Satellitisme des plaquettes ou satellitose  (= phénomène de rosettes leuco-plaquettaires lorsqu’il est anticoagulé par l’EDTA: les plaquettes entourent ou adhèrent aux neutrophiles), ce qui pourrait provoquer une pseudothrombocytopénie au cours de comptage plaquettaire automatisés. la pseudoleucocytose survient lorsque les amas de plaquettes ont une taille similaire à celle des globules blancs et que les analyseurs automatiques ne pourrait pas distinguer les deux: Les amas plaquettaires sont parfois comptés en tant que globules blancs au lieu de plaquettes. Les auto-anticorps anti-plaquettaires pourraient  également produire des agregats plaquettaires  à température ambiante ce qui pourrait expliquer ce phénomène.

Dans ces circonstances, l’examen de frottis sanguin devient une stratégie de contrôle qui nous permet d’identifier ces phénomènes afin de les corriger avant le test. les résultats sont reportés dans le dossier du patient.

Ces phénomènes aberrants peuvent être éliminés en collectant à nouveau les échantillons dans des tubes en citrate de sodium (bouchon bleu clair) et en respectant les proportions sang/anticoagulant 9:1(V/V)  (un tube correctement rempli jusqu’au cercle gravé). Ces nouveaux échantillons peuvent être analysés de la manière habituelle par des instruments automatisés.

La numération plaquettaire et la numération des leucocytes des échantillons  citratés doivent être corrigées en tenant  compte de la dilution du sang avec l'anticoagulant: dans un tube d'aspiration complète, le sang représente neuf dixièmes du volume total du tube (2,7 mL de sang et 0,3 mL de citrate de sodium). Le «facteur de dilution» est l’inverse de la dilution (c’est-à-dire 10/9 ou 1,1). Le nombre de globules blancs et de plaquettes est multiplié par 1,1 pour obtenir des résultats précis. Tous les autres paramètres CBC doivent être consignés pour l'échantillon de tube EDTA et la lame.

II. Préparation des frottis sanguin

La réalisation de frottis sanguin est probablement la technique la plus simpleà maîtriser. C'est la méthode la plus pratique et la plus utilisée au laboratoire.

Matériels:

-  deux lames de verre propres de 3 pouces × 1 pouce (75 mm × 25 mm).

- Capillaires à micro-hématocrites

PS: Il est recommandé d'utiliser des lames de microscopie de haute qualité à bords biseautés. 

Etapes: 

- inverser délicatement le tube du sang une dizaine de fois pour bien  mélanger les composantes sanguines;

- Enlever le bouchon du tube et aspirer le sang dans les capillaires  de micro-hématocrite par capillarité;vous pouvez vous servir de votre index pour boucher l'extrémité dés que le tube capillaire est rempli au 3/4;

- dépose ensuite une goute du sang de 3 à 4 mm de diamètre sur une extrémité de la lame;

- Placer cette lame perpendiculairement à vous.

- Avec une deuxième lame, placer à un angle approximatif de 45 °et reculer dans la goute afin de l'etaler celle ci au 2/3 ou 3/4 de la largeur de la lame et doucement glisser la lame inclinée vers l'avant afin d'étaler le frottis sanguin.

- laisser la lame sécher naturellement.

Conseils pratiques

- La taille de la goutte de sang est importante: une goutte trop grosse forme un frottis long ou épais, et invesement une trop petite goutte forme souvent un frottis court ou mince.

- Avancer lentement la lame conduit à une mauvaise distribution des leucocytes en poussant des cellules de grandes tailles , telles que les monocytes et les granulocytes, à l'extrémité et sur les côtés du frottis.

-  Maintenir une pression douce et régulière sur la lame glissée est essentiel et garder le même angle jusqu’à la fin du frottis.

- Lorsque l'hématocrite est supérieur à la normale, comme c'est le cas chez les patients atteints de polycythémie ou chez les nouveau-nés, l'angle doit être abaissé (c'est-à-dire à 25 degrés), de sorte que le film ne soit pas trop court ni trop épais. Pour un hématocrite extrêmement faible, l'angle doit peut  être augmenté. 

 

Caractéristiques d'un frottis sanguin bien ètalé:

1. Le frottis mesure de deux à trois quarts de la longueur de la lame;

2. Le frottis est en forme de doigt, très légèrement arrondi au bord, (non en forme de balle;

3. Les bords latéraux du frottis sont visibles;

4. Le frottis est lisse, sans irrégularités, ni trous ou stries.

les erreurs à éviter ( auto-remédiation)

Lame A: Un bord ébréché ou rugueux sur la lame.

Lame B: Hésitation face à l'étalement

Lame C: la lame a été poussé trop vite.

Lame D: la goutte de sang trop petite.

 

Lame E Une goutte de sang ne doit pas s'étendre sur toute la largeur de la lame.

Lame F: la lame graissé ; peut également être due à une hyperlipidémie de l’échantillon de sang.

Lame G: pression maintenue inégalemnt sur toute la longeur de la lame.

Lame H: goutte de sang qui a commencé à sécher